I. TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này, tinh dầu Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) thu hái ở Khu bảo tồn thiên nhiên (BTTN) Pù Huống, Nghệ An đã được xác định thành phần hóa học bằng hệ thống sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS). Kết quả phân tích có tổng số 30 hợp chất được xác định. Trong đó, nhóm chất chính là oxygenated monoterpene chiếm 71,5%. Các hợp chất chính có trong tinh dầu Bách xanh bao gồm methyl cumate (32,7%), αterpineol (12,4%), 2-methoxybenzyl alcohol, n-propyl ether (11%) và myrtenoic acid (10,5%). Ngoài ra, dựa trên thử nghiệm hoạt tính kháng (Chống – Oxi hóa) DPPH, tinh dầu Bách xanh thể hiện khả năng kháng oxy hoá với giá trị IC50 = 3,19 ± 0,38 mg/mL (đối chứng dương, ascorbic acid có giá trị IC50 = 0,02 mg/mL). Trong nghiên cứu hiện tại của chúng tôi, lần đầu tiên hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu Bách xanh (C. macrolepis) ở Việt Nam được công bố. Kết quả nghiên cứu cũng góp phần cung cấp thông tin khoa học về hoá thực vật, hoạt tính sinh học và sự đa dạng về nguồn thực vật của Khu BTTN Pù Huống, tỉnh Nghệ An.
II. MỞ ĐẦU
Nằm trong hệ thống các khu rừng đặc dụng của Việt Nam, Khu BTTN Pù Huống cùng với Vườn quốc gia Pù Mát, Khu BTTN Pù Hoạt là vùng lõi quan trọng của khu dự trữ sinh quyển Miền Tây Nghệ An. Khu BTTN Pù Huống là nơi trú ấn và phân bố của các loài động, thực vật quý hiếm. Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) thuộc họ Hoàng Đàn (Cupressaceae) ngành Thông (Pinophyta) được ghi nhận phân bố ở Ấn Độ, Đông bắc Mianma, Thái Lan, Lào, Mỹ (Nam Caliphonia), Đài Loan, Đông Nam Trung Quốc và ở Việt Nam phân bố chủ yếu ở Lào Cai, Sơn La (Yên Châu: Mường Lựm, Vân Hồ), Hà Giang, Hoà Bình (Mai Châu: Hang Kia, Pà Cò; Đà Bắc), Hà Tây (Ba Vì), Đắk Lắk (Krông Bông: Chư Yang Sinh), Lâm Đồng (Đà Lạt, Bì Đúp), Khánh Hoà (Nha Trang, Hòn Bà), Ninh Thuận, Nghệ An (Khu BTTN Pù Huống, Khu BTTN Pù Hoạt). Trên thế giới Chi Bách xanh (Calocedrus) có khoảng 3 loài và 1 thứ là Calocedrus decurrens, Calocedrus macrolepis, Calocedrus macrolepis var. formosana, Calocedrus rupestris (Fajon, 2005; Fu et al., 1999). Bách xanh là loài thực vật quý hiếm có trong sách Đỏ Việt Nam 2007 với cấp cần bảo vệ là nguy cấp. Bách xanh cho gỗ có giá trị do vân đẹp, thớ thẳng, chịu mối mọt, dễ gia công. Gỗ được sử dụng cho xây dựng, làm bàn tủ, đồ gỗ văn phòng và đồ mỹ nghệ. Gỗ còn được dùng làm hương liệu và chiết tinh dầu.
Hình ảnh về cây Bách xanh được minh hoạ ở Hình 1.
Cho đến nay đã có một số tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu Bách xanh. Nghiên cứu của Adams và đồng tác giả (2006) đã cho thấy thành phần hóa học chủ yếu của tinh dầu từ lá ở loài Calocedrus decurrens là -3-carnen (20,2%) và limonen (23,6%), ở loài Calocedrus macrolepis thành phần chính là α-pinen (67,1%) và mycren (11,2%); và ở thứ Calocedrus macrolepis var. formosana là α-pinen (57,2%) và limonen (13,9%). Trong một nghiên cứu khác, Cheng và đồng tác giả (2008) đã nghiên cứu hoạt tính sinh học từ vỏ thân của loài Calocedrus macrolepis var. formosana và cho biết chúng có khả năng chống oxy hóa mạnh. Wang và đồng tác giả (2006) phân tích tinh dầu một số loài hạt trần ở Đài Loan trong đó loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis) có thành phần hóa học chính của tinh dầu là β-elemen (15,8%), -cadinen (12,1%), α-pinen (11,1%) và limonen (10,8%). Ở Việt Nam, Nguyễn Quang Hưng và đồng tác giả (2011) đã báo cáo thành phần hóa học chủ yếu của tinh dầu từ cành loài Calocedrus decurrens thu hái tại Hà Giang gồm có các thành phần chính là axít benzoic (23,3%) và dodecan-7-ol (14,6%). Các nghiên cứu khoa học hiện đại đã chỉ ra rằng, cây Bách xanh có chứa tinh dầu với nhiều hoạt tính sinh học quý, như hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, ức chế enzyme, kháng nấm (Chang et al., 2008; Shyu et al., 2023). Nghiên cứu góp phần cung cấp cơ sở dữ liệu cho loài thực vật này ở Khu BTTN Pù Huống, Nghệ An.
III. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Nguyên liệu
Cành và thân của loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis) được thu hái ở Khu BTTN Pù Huống (khu vực huyện Tương Dương, tỉnh Nghệ An) vào tháng 5 năm 2023. Mẫu thực vật được định danh bởi Tiến sĩ Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Tiêu bản của loài này (số hiệu PH26) hiện đang được lưu trữ tại Ban quản lý Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống.
2. Phương pháp nghiên cứu
Chưng cất tinh dầu Mẫu để chưng cất tinh dầu là cành và thân cây Bách xanh (C. macrolepis). Mẫu nghiên cứu (3,0 kg tươi) được làm sạch, cắt nhỏ, để khô tự nhiên trong bóng râm. Sau khi đã khô, mẫu nghiên cứu được chưng cất theo phương pháp lôi cuốn hơi nước sử dụng bộ chưng cất tinh dầu Clevenger ở áp suất thường đến khi thu được lượng tinh dầu tối đa (khoảng 4 giờ), theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V (2017). Xác định hiệu suất chưng cất tinh dầu Tinh dầu của cành và thân cây Bách xanh được xác định hàm lượng theo phương pháp I (Dược điển Việt Nam V, 2017). Hàm lượng tinh dầu tươi được tính theo công thức:
Trong đó: a là khối lượng của tinh dầu tính bằng gam; b là khối lượng của mẫu tính bằng gam. Tinh dầu được làm khô bằng Na2SO4 khan (Merck). Sau đó tinh dầu được đựng trong các lọ tiêu chuẩn đậy kín, bảo quản ở 0-5oC trước khi phân tích. Phân tích và xác định thành phần hoá học
Thành phần hóa học của cành và thân cây Bách xanh được phân tích trên hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) của hãng Agilent Technologies, bao gồm thiết bị sắc ký khí GC 7890B ghép nối thiết bị khối phổ MS 5977BƠ. Cột sắc ký sử dụng là cột HP-5MS Ultra Inert có kích thước 30 m 0,25 mm 0,25 µm. Helium (He) được sử dụng làm khí mang với tốc độ 1,0 mL/phút. Mẫu tinh dầu được pha loãng trong dung môi dichloromethan (CH2Cl2) theo tỉ lệ thể tích là 1/100, sau đó được bơm (1,0 μL) vào hệ thống sắc ký khí GC theo tỉ lệ chia 25/1. Chương trình nhiệt được thiết lập như sau: Ban đầu, nhiệt độ lò GC được giữ ở 60°C trong 3 phút, sau đó tăng lên 180°C với tốc độ 3°C/phút, tiếp tục tăng lên 240°C với tốc độ 5°C/phút và cuối cùng giữ nhiệt độ ở 240°C trong 5 phút. Thành phần hoá học của tinh dầu được xác định dựa trên sự so sánh chỉ số lưu giữ (RI) kết hợp với phổ khối định danh sử dụng thư viện NIST17 và tài liệu tham khảo (Dai et al., 2013). Thành phần phần trăm của mỗi chất trong mẫu tinh dầu được định lượng bằng cách chia diện tích pic tương ứng của chúng cho tổng diện tích pic của tất cả các thành phần, sau đó nhân kết quả với 100 (Fajon, 2005). Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên phần mềm Qualitative Navigator (Version B.08.00).
Xác định hoạt tính kháng oxy hóa
Hoạt tính kháng oxy hoá của mẫu tinh dầu được đánh giá thông qua khả năng bắt giữ gốc tự do (DPPH) thực hiện bằng phương pháp quang phổ UV, chất chuẩn là ascorbic acid. Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên phản ứng các chất kháng oxy hóa có trong mẫu thử với gốc DPPH*, chất kháng oxy hóa sẽ khử DPPH* (màu tím) thành DPPH (màu vàng nhạt) làm giảm độ hấp thu.
Các bước thực hiện:
- Chuẩn bị dung dịch DPPH: Cân 0,012 g DPPH, hòa tan trong methanol trong bình định mức. Khuấy trong 30 phút đến khi tan hết, hạn chế tiếp xúc ánh sáng. Định mức lại bằng methanol. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4ºC), và sử dụng trong 3 tuần.
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: ascorbic acid được pha loãng trong nước ở các nồng độ 0-100 µg/mL.
- Chuẩn bị mẫu: mẫu tinh dầu được pha loãng bằng DMSO thành dãy nồng độ phù hợp.
- Mẫu hoặc chất đối chứng sẽ được phản ứng với dung dịch DPPH theo tỉ lệ 1/1, thực hiện ở nhiệt độ phòng, thời gian 30 phút, trong bóng tối. Sau đó hỗn hợp phản ứng được đo quang phổ hấp thu ở bước sóng 517 nm. - Khả năng bắt giữ gốc tự do được tính theo công thức sau:
Trong đó, OD (a): giá trị mật độ quang OD của chứng âm; OD (b): giá trị mật độ quang OD của mẫu. Giá trị IC50 là nồng độ mẫu (mg/mL) có khả năng ức chế 50% gốc tự do, với giá trị IC50 càng thấp, hoạt tính kháng oxy hóa càng cao.
IV. KẾT QUẢ
Thành phần hóa học của tinh dầu Bách xanh
Tinh dầu Bách xanh có dạng lỏng, nhẹ hơn nước, màu vàng nhạt, mùi thơm đặc trưng. Hàm lượng tinh dầu được tính theo nguyên liệu khô là 0,35%. Sắc khí đồ GC và thành phần hoá học của tinh dầu được trình bày ở Hình 2 và Bảng 1 sau đây:
Kết quả phân tích GC/MS cho thấy có tổng số 30 hợp chất đã được xác định, chiếm 91,8% thành phần các hợp chất bay hơi.
Chú thích: STT: số thứ tự; RT: thời gian lưu (phút); RI (a): chỉ số lưu giữ thực nghiệm; RI (b): chỉ số lưu giữ tham khảo.
Cụ thể, nhóm chất oxygenated monoterpene chiếm hàm lượng lớn nhất trong tinh dầu Bách xanh với 71,5%. Các nhóm chất khác bao gồm monoterpene hydrocarbon (5,3%), nhóm chất sesquiterpene hydrocarbon (1,3%) và các hợp chất khác (13,7%). Các hợp chất chính (> 5%) của tinh dầu Bách xanh thu hái ở Pù Huống, Nghệ An là methyl cumate (32,7%), α-terpineol (12,4%), 2-methoxybenzyl alcohol, n-propyl ether (11%) và myrtenoic acid (10,5%). Bên cạnh đó, một số hợp chất đáng chú ý khác (> 2%) bao gồm 4-thujen-2-α-yl acetate (3,9%), pcymen-8-ol (3,7%), α-fenchene (2,6%), benzenemethanol, 4-hydroxy- (2,3%) và verbenone (2,1%).
Các kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học tinh dầu Bách xanh trong nghiên cứu hiện tại của chúng tôi và các nghiên cứu trước đây có một số điểm khác biệt. Ví dụ, tinh dầu của lá Bách xanh ở rừng thực nghiệm của Đại học Quốc gia Đài Loan có các thành phần chính là a-pinene (44,2%), limonene (21,6%), b-myrcene (8,9%), b-caryophyllene (8,2%) (Chang et al., 2008). Trong khi đó, tinh dầu lá Bách xanh ở núi Dalong, Miaoli, Đài Loan gồm có α-pinene (36,4%), limonene (23,6%); tinh dầu cành cây gồm có α-pinene (36,2%), ferruginol (22,5%) và limonene (13,1%) (Shyu et al., 2023). Tinh dầu gỗ Bách xanh thu hái ở tỉnh Khánh Hoà, Việt Nam có các thành phần chính là α-terpineol (11,6%) và myrtenal (10,6%), bornyl acetate (5,6%) và carvacrol methyl ester (5,6%) (Dai et al., 2013). Trong khi đó, tinh dầu cành Bách xanh ở tỉnh Hà Giang, Việt Nam có các thành phần chính là benzoic acid (23,3%), dodecan-7 ol (14,6%), triethylenehexane (7,3%), α-terpineol (6,6%) và 1,3-cyclooctadiene (5,8%) (Hung et al., 2011). Sự khác biệt về thành phần hoá học tinh dầu Bách xanh giữa các nghiên cứu có thể do các yếu tố sau: thời gian và địa điểm thu mẫu, phương pháp chưng cất tinh dầu, ...
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá bằng thử nghiệm DPPH
Khả năng kháng oxy hóa là một trong các đặc tính sinh học quan trọng của tinh dầu. Kết quả xác định khả năng kháng oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH của mẫu tinh dầu Bách xanh ở Khu BTTN Pù Huống, Nghệ An được trình bày trong Bảng 2.
Trong nghiên cứu hiện tại, hoạt tính kháng oxy hoá của tinh dầu Bách xanh thu hái tại Pù Huống, Nghệ An có giá trị IC50 3,19 ± 0,38 mg/mL, cao hơn nhiều so với đối chứng dương (ascorbic acid) có giá trị IC50 0,02 mg/mL. Giá trị này cũng cao hơn đối với tinh dầu Bách xanh ở Miaoli, Đài Loan (IC50 0,12 mg/mL) trong một nghiên cứu trước đây (Adam et al., 2006). Sự khác nhau về hoạt tính sinh học của các mẫu tinh dầu phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng phần trăm của các hợp chất có trong các mẫu tinh dầu nghiên cứu.
V. KẾT LUẬN
Nghiên cứu nhằm xác định thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu Bách xanh thu hái ở Khu BTTN Pù Huống, tỉnh Nghệ An. Kết quả nghiên cứu cho thấy các thành phần hóa học chính của tinh dầu Bách xanh bao gồm methyl cumate (32,7%), α-terpineol (12,4%), 2-methoxybenzyl alcohol, n-propyl ether (11%) và myrtenoic acid (10,5%). Bên cạnh đó, kết quả thử nghiệm DPPH cho thấy tinh dầu này có hoạt tính kháng oxy hóa với giá trị IC50 3,19 ± 0,38 mg/mL.
Tổng hợp theo tài liệu khoa học của Khu Bảo tồn thiên nhiên Pù Huống
Ngô Hải Lưu
Văn phòng Ban Quản lý
